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藥審要點丨幼齡動物毒理學試驗的案例分析及考慮要點
2023/07/11
幼齡動物毒理學試驗的案例分析及考慮要點
單曉蕾，黃芳華 * ，姜凱迪
( 國家藥品監督管理局藥品審評中心，北京 100022 )
摘 要
近年來兒童用藥成為藥物開發熱點，兒童人群臨床試驗逐漸增多。當支持開展兒童臨床試驗安全性的非臨床和臨床數據缺乏時，需要考慮開展幼齡動物試驗，旨在闡述在其他非臨床試驗或兒童臨床試驗中無法得到充分闡述的安全性問題，包括潛在的長期安全性的影響。該文基于 2020 年發布的 ICH S11 支持兒童用藥開發的非臨床安全性指導原則并結合實際案例，闡述了幼齡動物試驗的設計和實施的考慮要點，以期為我國兒童用藥開發提供參考。
關鍵詞
ICH S11；幼齡動物試驗；兒童用藥開發
正 文
近年來，我國持續鼓勵、促進兒童用藥的研發創新，兒童用藥的申報、審評數量呈現逐年上升的趨勢。擬開發用于兒童人群的藥品，包括已經在成年人中使用的產品以及考慮首次用于兒童人群的產品，應根據具體情況考慮開展幼齡動物毒理學試驗( 簡稱幼齡動物試驗，juvenile animal study，JAS)。JAS 的設計、實施具有復雜性和較大難度，本文將結合案例，對 JAS 的一些考慮要點進行闡述和分析，為兒童用藥的研發提供參考。
No.1
兒科藥物開發的非臨床安全性評價指導原則
由于兒童處于生長發育階段，器官系統不成熟或在藥物治療期間系統成熟，對藥物的藥動學、藥效學和脫靶效應可能產生影響，進而引起兒童人群在藥物安全性和有效性方面與成人存在差異。因此，需要考慮是否需要進行 JAS，用以闡述其他非臨床試驗或兒童臨床試驗中無法得到充分闡述的安全性問題[1] 。
從 21 世紀開始，各國陸續發布了支持兒童用藥開發的非臨床安全性研究指導原則。FDA 于2006年發布了《兒科用藥的非臨床安全性評價指導原則》(Guidance for Industry: Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products) [2] ；EMA 于2008年發布了《兒科適應證用藥的幼齡動物非臨床試驗必要性指導原則》(Guideline on the Need for Nonclinical Testing in Juvenile Animals on Human Pharmaceuticals for Pediatric Indications) [3] ，日本厚生勞動省 (Ministry of Health Labour and Welfare,MHLW) 于 2012 年發布了《兒科用藥幼齡動物非臨床安全性研究指導原則》(Guideline on Nonclinical Safety Studies in Juvenile Animals for Pediatric Drug Development) [4] 。為了促進區域間的協調一致，國際人用藥品注冊技術要求理事會 (ICH) 于 2014 年開始組建了 S11 專家工作組，對支持兒童用藥開發的非臨床安全性研究內容進行國際協調，于 2020年 4 月 14 日發布了 ICH S11《支持兒科藥物開發的非臨床安全性評價指導原則》(以下簡稱 S11)[1] ，我國國家藥品監督管理局 (National Medical Products Administration，NMPA) 作為 ICH 成員參與了 ICH S11 的議題協調工作，并于 2021 年 1 月 21 日發布S11 實施公告 (2021年第15號)。
S11 推薦了支持兒童用藥開發的非臨床安全性評價的國際協調一致的標準，適用于擬開發用于兒童人群的小分子藥物和生物制品，提出了 JAS 的必要性及 JAS 設計的具體要求。由于 JAS 的必要性和其試驗設計需要具體問題具體分析，具有相當的靈活性，因此，本文結合案例分析，對幼齡動物試驗的一些考慮要點進行探討分析，以期為我國兒童用藥開發提供參考。
No.2
附加 JAS 的考慮
ICH M3 和 S11 提出[1,5]：只有當已有的非臨床和臨床研究數據被認為不足以支持兒科研究時，才應進行附加的非臨床試驗。該附加的非臨床試驗一般是指 JAS。S11 對于是否需要進行附加的非臨床安全性研究，提出了證據權重 (weigh of evidence，WoE) 法，WoE 評價需考慮的關鍵因素包括但不限于擬用患者的最小年齡、對發育中器官的不良影響、已有資料的數量和類型 ( 包括臨床資料和非臨床等資料 )、藥物靶點對器官發育的作用、藥物的選擇性和特異性，以及臨床給藥期限等。其中，擬用患者的最小年齡以及對發育中器官系統的不良影響最為重要 ( 即最高權重 )。WoE 法需同時評估多種因素，應考慮每個因素的重要性，以最終確定現有數據是否能充分闡述在所申請兒童人群中的安全性擔憂，或者附加的 JAS 能否闡述這些擔憂[1] 。
拉考沙胺 (Lacosamide，商品名 Vimpat) 是美國 USB 公司開發的一種抗癲癇藥物，于2008年10月首次被FDA批準上市，用于17歲以上患者人群[6] ，并要求上市后開展1月齡至17歲兒童的臨床試驗[7] 。基于拉考沙胺上市后開展的多項兒童臨床試驗數據，目前 FDA 批準拉考沙胺用于 1 月齡以上患者癲癇部分性發作的治療以及 4 歲及以上患者原發性全身性強直陣攣發作的輔助治療[8] 。
拉考沙胺作用于中樞神經系統 (central nervoussystem，CNS)，臨床擬用患者年齡最低為 1 月齡，現有資料尚不足以說明對兒童用藥的安全性，且靶點和毒理學試驗均提示存在對發育中的 CNS 有潛在影響的擔憂。因此，拉考沙胺完成的非臨床安全性研究除一般的毒理學數據包 ( 包括大鼠、犬單次和重復給藥毒性試驗，遺傳毒性、生殖毒性、致癌性試驗 ) 外，為支持兒童人群的臨床試驗，進行了幼齡大鼠重復給藥毒性試驗，另外申請上市前還進行了幼齡犬重復給藥毒性劑量范圍探索試驗 (GLP試驗)[9] 。此外，該品種還進行了幼齡犬 33 周重復給藥毒性試驗。
拉考沙胺大鼠 JAS 中，幼齡大鼠從出生后日齡(postnatal day，PND)7 開始經口給予拉考沙胺 (每天 30、90、180 mg/kg)，連續給藥 42 d，可見哺乳期間體重降低、雌性性成熟延遲、腦絕對和相對重量降低以及長期的神經行為改變 ( 曠場行為改變、學習和記憶缺陷 )[6,9] ，且大鼠發育神經毒性的無影響劑量下的暴露量低于人最大推薦劑量每天 400 mg時的暴露量。另外，體外試驗結果顯示，拉考沙胺會干擾涉及神經元分化和控制軸突向外生長的腦衰反應調節蛋白 -2(CRMP-2) 的活性[8] 。因此，不能排除拉考沙胺對 CNS 發育的潛在相關不良反應。
綜上，拉考沙胺作為一種 CNS 藥物，臨床擬用患者最小年齡為1月齡，根據已有研究結果，不能排除藥物對發育中的 CNS 潛在擔憂，在兒童臨床試驗之前開展了大鼠 JAS，并可見拉考沙胺對大鼠 CNS 發育具有不良影響。值得注意的是，一般認為，在腦發育方面，大鼠出生后早期對應于人類妊娠晚期，因此，FDA 將上述風險提示信息寫入說明書“特殊人群用藥”項的“妊娠”和“兒科用藥”中，為臨床使用提供安全性信息[8] 。
No.3
試驗設計要點
3.1 動物種屬選擇
在已有支持成人臨床試驗的毒理學數據包基礎上，當需要進行 JAS 時，大多數情況下單一動物種屬試驗是足夠的，原則上，在成年動物重復給藥毒性試驗中所使用的相同種屬應是 JAS 首先考慮的種屬，首選嚙齒類動物。在所有情況下，應證明所選擇的種屬是合理的，為相關動物種屬。只有在先用于兒科或對出生后發育有多種特殊擔憂而單一種屬無法闡述這些擔憂的情況下，才需要進行 2 種種屬的 JAS [1] 。
大鼠是成年動物重復給藥毒性試驗的常用種屬，具有豐富的歷史對照資料，且其發育時間短使得試驗中可納入大量的終點指標，觀察出生后多個器官系統的發育，因此大鼠 ( 在其為相關動物種屬時 ) 是 JAS 較常使用的動物。對于生物制品，大多數情況下非人靈長類 (non-human primate，NHP)為藥理學相關種屬，但由于科學和實際操作的原因，對離乳前 NHP 進行 JAS 具有很大的挑戰性( 例如繁殖、運輸和母體 / 嬰仔對的處理 )，而離乳后 NHP( 大約 6 月齡 ) 器官系統的成熟度通常已超過了許多兒科相關年齡，在離乳后 NHP 中進行JAS 所增加的價值有限，只有在少數情況下，在離乳前 NHP 中進行 JAS 具有合理的價值，例如在擬用于新生兒和強化的圍產期發育 (enhanced pre- and postnated developmental，ePPND) 試驗中的暴露不充分的情況，因此，S11 鼓勵采用替代方法 ( 如體外試驗、轉基因動物、替代分子 ) [1] 。
先用于兒科或兒科專用藥物通常的臨床策略通常是在兒科試驗之前，先在健康成年志愿者進行首次人體 (FIH) 試驗。但是，有一些案例，在沒有成年患者或是健康志愿者數據的情況下對患兒給藥( 例如，僅存在于兒童中的危急生命或衰弱的疾病，或者當藥物無法安全地給予成年志愿者時 )，FIH 試驗將在患兒中進行，此時非臨床計劃通常將包括一種嚙齒類動物和一種非嚙齒動物的 JAS，以及與成人用藥所需相同的安全藥理學和遺傳毒性試驗[1] 。
以下描述一個兒科專用藥物采用 2 種幼齡動物種屬進行毒理學的案例。
諾西那生鈉 (nusinersen，商品名 Spinraza) 為美國 Biogen Idec 公司開發的一種反義寡核苷酸(ASO) 藥物，可增加運動神經原存活基因 2 （survival motorneuron 2，SMN2）的 mRNA 轉錄本中外顯子7的納入以及全長 SMN 蛋白產生，經腰椎穿刺鞘內給藥，用于治療因染色體 5q 突變導致 SMN 蛋白缺乏而引起的脊髓性肌萎縮癥 (spinal muscular atrophy，SMA)，一種造成嬰幼兒死亡的嚴重的常染色體隱性遺傳疾病。諾西那生鈉于2016年12月經美國 FDA 批準上市，適用人群包括新生兒至17歲少年[10] 。
諾西那生鈉在上市前完成的非臨床安全性研究包括 ：大鼠鞘內給藥安全藥理學試驗、遺傳毒性試驗 [ 細菌回復突變試驗、體外中國倉鼠卵巢細胞 (Chinese hamster ovary cell，CHO 細胞 ) 染色體畸變試驗、小鼠體內骨髓微核試驗 ]、生殖毒性試驗 ( 小鼠生育力與胚胎發育試驗、兔胚胎 - 胎仔發育毒性試驗 )，以及幼齡猴和小鼠的毒性試驗[11] 。FDA 要求上市后完成小鼠皮下給藥 2 年致癌性試驗以及嚙齒類動物的圍產期毒性試驗[12] 。
重復給藥毒性試驗方面，諾西那生鈉進行了2種動物的 JAS，包括幼齡食蟹猴 14 周和 53 周重復給藥毒性試驗、幼齡小鼠 13 周重復給藥毒性試驗共 3 個試驗，其中食蟹猴在 ASO 的組織分布、細胞攝取、代謝和毒性敏感性方面更具代表性，故食蟹猴試驗為核心試驗。幼齡食蟹猴鞘內注射給予諾西那生鈉每次 0.3、1、3 mg 連續 14 周 ( 猴給藥起始年齡為 9 ～ 10 周齡，負荷劑量階段每周給藥 1 次，共 5 次，之后維持階段每 2 周 1 次或每周給藥 1 次 )或每次 0.3、1、4 mg 連續53 周 ( 猴給藥起始年齡為 9 ～ 11 月齡，負荷劑量階段每周給藥 1 次，共 5 次，之后維持階段為每 6 周給藥 1 次 )。2 個試驗中，高、中劑量組可見腦組織病理學改變 ( 海馬神經元空泡化和壞死以及細胞碎片 )，高劑量組可見急性、短暫的低位脊髓反射缺陷。此外，猴 53 周試驗中，高劑量組學習和記憶檢測可見可能的神經行為學缺陷。按年計算并校正了不同種屬間腦脊液體積差異后，猴神經組織病理學無影響劑量 (每次0.3 mg) 大約相當于人用劑量[10—11] 。另外進行了幼齡 CD-1 小鼠 13 周重復給藥毒性試驗，于出生后4 ～ 95 d 給藥，在最高每次 50 mg/kg 的劑量下耐受性較好，可見寡核苷酸相關的變化[11] 。
綜上，作為全球首個批準用于 SMA 治療的 ASO 藥物，諾西那生鈉為兒科專用藥物，擬用患者最小年齡為新生兒，直接對兒童開展臨床試驗，非臨床安全性研究進行了幼齡小鼠3個月毒理學試驗、幼齡食蟹猴鞘內給藥 ( 臨床擬用途徑 )4 周和 53 周毒理學試驗，并附加進行了 CNS 評估，可見對神經系統的不良影響，該風險提示信息納入說明書。
3.2 動物開始給藥年齡
動物開始給藥年齡是 JAS 設計的關鍵性要素，應選擇在發育上對應擬用患者的最小年齡，并考慮人與動物的毒理學擔憂器官系統發育期的比較。由于不同種屬之間不同器官的器官系統相關性并不一致，應優先考慮任何潛在擔憂的靶器官 / 系統，或者是擬用患者人群中特別脆弱的正在發育中的系統[1] 。S11 在附錄中詳細列出不同動物種屬器官系統的比較發育的概況，可以幫助選擇合適的動物種屬和年齡，以充分闡述所申請的兒童人群的安全性擔憂。
在 2011 年發表的一項針對來自美國、歐洲和日本的 24 家制藥公司的有關兒童藥物非臨床安全性研究的調查中[13] ，根據該調查中提供的給藥開始年齡的有限數量的試驗，似乎在 1990 年代末和2000 年代初存在一種趨勢，在最早的可給藥年齡開始給藥，而不是在代表發育階段的年齡開始給藥。在 118 項大鼠 JAS 試驗中，94 項是在離乳前開始給藥，但僅有 23 個受試物擬定患者人群為新生兒，其余均用于 2 歲以上兒童。該趨勢在 2006 年初開始轉變為更具代表性的年齡，這種轉變與 FDA 于2006年發布的指導原則相對應。國內JAS起步較晚，實踐經驗尚不成熟，采用離乳前動物開展試驗存在一定難度，因此常常出現 JAS 試驗動物開始給藥年齡偏大而不能支持臨床試驗擬用患者最小年齡的情況。
在 2019 年發表的一篇針對 15 種靶向 CNS 藥物的 JAS 研究 ( 均來源于 EMA 兒科委員會的電子文檔資料 ) 文獻中[14] ，描述了一項動物開始給藥年齡偏大的案例。Epi6( 代碼，出于商業保護原因未列出產品名稱 ) 用于癲癇部分發作性的治療，擬用患者包括了早產新生兒，在關鍵性 JAS 試驗中，大鼠開始給藥年齡為 PND28，從 CNS 發育階段來看，PND28 大于擬用患者的最小年齡，另外，與PND28 開始給藥大鼠相比，從 PND21 開始給藥的大鼠毒性嚴重程度明顯升高 ( 基于在年齡更小大鼠中在更低的劑量下發生嚴重的臨床癥狀而導致終末前安樂死 )，說明在更小日齡的大鼠中毒性更敏感。因此，大鼠從 PND28 開始給藥錯過了腦發育的敏感關鍵窗口期，無法敏感地檢測到受試物相關的不良影響。
3.3 劑量探索試驗
JAS 試驗開展難度大，多種因素可影響其試驗成敗，因此，在正式試驗前應考慮進行劑量范圍探索 (dose range-finding，DRF) 試驗，S11 推薦以小組別的幼齡動物進行 DRF 試驗，評估與暴露量和年齡相關的耐受性，這對離乳前開始給藥的正式JAS 尤其有價值，可避免大部分由不相關暴露量所致的意外死亡或過度毒性。DRF 應在正式 JAS 中所計劃動物起始年齡的最小年齡給藥，以評價耐受性和暴露量差異的最關鍵時期。在正式 JAS 中，給藥方案應使在所擔憂的發育期間能達到和維持相關暴露量。若動物吸收、分布、代謝和排泄 (ADME)系統的成熟導致系統暴露量發生明顯變化，應考慮正式 JAS 過程中進行劑量調整 ( 增加或減少 )，以使暴露量保持在某種程度的一致性和臨床相關性。通常在 JAS 期間劑量調整預計不會超過一次[1] 。
POSOBIEC 等描述了一個基于 DRF 結果在正式JAS中進行劑量調整的一個案例[15] 。在該案例中，為支持 3 月齡至成年患者人群的用藥，計劃開展一項于 PND7 ～ 45 給藥的大鼠 JAS。由于在成年大鼠毒性試驗中觀察到可能與藥理學作用相關的卵巢毒性 (每天 0.02 mg/kg)，故將 JAS 給藥期持續至雌性大鼠預期性成熟前，使 JAS 與成年動物毒性試驗的給藥期有重合，并在 JAS 中對性成熟動物評估動情周期。首先進行了一項大鼠 PND7 ～ 21 給藥的探索性試驗，劑量≥ 0.1 mg/kg 時可見嚴重毒性 ；接著，進行了一項大鼠 PND7 ～ 35 給藥的初步劑量探索試驗，給藥劑量為 0.01、0.02 和 0.05 mg/kg，并于 PND13、21、35 進行毒代檢測，可見給藥期間藥物暴露量出現急劇下降，在終末時間點 (PND35)3個劑量下的暴露量接近，并且低于預期的臨床暴露量。接下來進行了一項劑量范圍試驗，大鼠分為 2 組，于 PND7 ～ 21 均給予 0.05 mg/kg，為探索如何在發育后期階段更好地保持暴露量的一致性，在PND22 開始增加劑量，一組增加到 0.08 mg/kg，另一組增加到 0.17 mg/kg，調整后 2 組的暴露量呈現明顯的區分。最后綜合以上劑量探索試驗結果，在正式JAS中，大鼠于PND7～21給藥劑量為0.012 5、0.025 和 0.05 mg/kg，從 PND22 開始將劑量增加為0.08、0.17 和 0.35 mg/kg。通過這種劑量調整設計，使暴露量與成年動物高劑量 ( 雌性 0.08 mg/kg、雄性 0.2 mg/kg) 有重合，同組大鼠在發育過程中藥物具有相對一致的暴露，3 個劑量組的暴露量得以區分，從而可觀察劑量 - 反應相關性，并且中、高劑量組暴露水平也涵蓋了預期臨床暴露量 370 ng·h - 1 ·ml -1。
3.4 終點指標選擇
JAS 終點指標包括核心終點指標和附加終點指標。核心終點指標中，除一般毒理學指標外還包含了生長 ( 體重和長骨長度 ) 和性發育 ( 例如，嚙齒類雌性動物陰道張開時間和雄性包皮分離時間 ) 等指標。另外，為了闡述已確定的擔憂，應基于 WoE 評價中所確定的擔憂類型和強度來確定納入附加終點指標，附加終點指標包括其他生長終點、骨骼評估、臨床病理學、解剖病理學、眼科檢查、CNS 評估、生殖評估和免疫評估等。由于神經發育毒性 (DNT)安全性風險高，在臨床試驗或上市后監測中難以檢測到，CNS 評估是 JAS 研究中經常附加的終點指標，尤其是對于具有 CNS 活性的藥品。
一項研究對 2009 年～ 2014 年間 FDA 審查的NDA 申請中具有 CNS 活性的 32 種藥物共 44 項JAS 試驗進行了總結分析[16] ，大多數藥物 (20/32)進行了一項大鼠 JAS，部分藥物 (11/32) 進行了大鼠和犬 2 種種屬的 JAS，僅一種藥物 (1/32) 進行了一項犬 JAS。在所有的 JAS 中都包括標準的一般毒理學參數和生長發育指標，通常還進行了擴展的神經組織病理學評估、骨密度測量、生殖評估、神經行為學 /CNS 功能評估。由于是具有 CNS 活性的藥物，超過一半的試驗 (25/44) 包含了擴展的神經病理學評估，而其余試驗 (19/44) 進行了常規的 CNS組織病理學檢查。由于藥物暴露發生在兒童患者骨形成和生長的動態時期，骨發育也是 JAS 的重點。有 23 項試驗設置了特定的骨發育終點 ( 除組織病理學外 )，其中，14 項試驗 ( 包括 8 項大鼠和 6 項犬試驗 ) 評估了骨長度和骨密度 ( 雙能 X 射線骨密度測定法 )，9 項試驗 ( 大鼠試驗 ) 僅包括骨長度。生殖評估方面，所有大鼠試驗 (32 項) 中評估了交配和妊娠結局指標，所有大鼠和犬試驗 (44 項) 都進行了生殖器官組織病理學評估，在 16 項大鼠和犬試驗中進行了精子分析。
在神經行為學 /CNS 功能評估方面，采用了多種神經學和神經行為學測試，其檢測指標因種屬而異，主要包括犬的神經系統檢查或功能觀察組合(FOB)，以及大鼠中更特異性和定量的評估，例如運動活動、聽覺驚嚇行為以及學習和記憶的檢測。所有 32 項大鼠試驗均使用自動化系統進行了一項或多項學習和記憶測試，且大多數試驗測定了運動活動和聽覺驚嚇行為。在大部分的大鼠 JAS 中，使用復雜的水迷宮評估了是否導致長期認知障礙，包括 Morris 水迷宮 (11 項)、Biel 水迷宮 (8 項) 和 Cincinnati 水迷宮 (8 項)。
這些 JAS 為兒童用藥提供了安全性信息，并納入了說明書中 (78％) 以提示風險，其中較常見的 CNS 影響是神經行為學異常，包括運動活動、聽覺驚嚇反射以及學習和記憶的變化。在納入說明書中的神經行為學影響中，54％的試驗發現這些影響是持久的，提示具有神經發育毒性。
No.4
總結
為支持兒童用藥開發的非臨床安全性評價對申請人、試驗研究者都存在挑戰，一方面是由于兒童藥物開發中非臨床 / 臨床試驗設計、實施具有難度，另一方面是對已有研究信息的綜合評估能力的要求。JAS 可為兒童人群的風險識別和表征提供重要的參考信息，且能闡述與特定發育時期藥物暴露風險相關的安全性擔憂，是兒童用藥開發的非臨床安全性評價重要方法。在證據權重分析 (WoE) 基礎上，具體問題具體分析，根據前期所獲得的各方面信息進行整體地、科學合理地設計 JAS，并且保證試驗過程的良好實施，才能夠獲得有價值的毒理學數據，以支持兒童臨床試驗的開展，保障兒童受試者的安全。
內容來源：中國醫藥工業雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2022, 53(11）
